Криоконсервация и разморозка эмбрионов.
Криоконсервация эмбрионов
Впервые криоконсервация (замораживание) эмбрионов было применено во вспомогательных репродуктивных технологиях (ВРТ) в 1982 году. Вероятность наступления беременности с иcпользованием размороженных эмбрионов составляет примерно 10-15%.
Криоконсервация эмбрионов
Процедуру криоконсервации эмбрионов проводят в том случае, если после проведения лечения методом ЭКО у пациентов остаются «лишние» эмбрионы с хорошими показателями. Замороженные эмбрионы хранят в специальных пластиковых соломинках, находящихся в жидком азоте. Ограничений на срок хранения эмбрионов нет. Имеются данные об удачной беременности и родах с использованием эмбрионов, хранившихся 10 лет.
Перенос размороженных эмбрионов
При отсутствии беременности после ЭКО с наступлением менструации (т.е. уже в следующем цикле) можно осуществлять перенос размороженных эмбрионов. В этом случае процедура роста фолликулов не проводится - назначаются лекарства, подготавливающие слизистую оболочку матки для переноса эмбрионов. Используемые препараты содержат женские гормоны, изменяющие в естественных условиях состояние слизистой оболочки матки во время второй фазы менструального цикла и готовят ее к имплантации эмбриона в случае успешного оплодотворения. Приблизительно в середине менструального цикла слизистая оболочка достигает нужных характеристик (толщины и структуры). Далее проводят размораживание эмбрионов и переносят их в полость матки. Так как при криоконсервации эмбрионов уплотняется их оболочка, проводится процедура вспомогательного хэтчинга (надсечение оболочки эмбриона).
Необходимые условия для криоконсервации эмбрионов
Криоконсервация эмбрионов проводится лишь для эмбрионов с хорошими показателями качества и на строго определенной стадии их развития. Эмбрионы с плохими показателями не замораживаются - иначе происходит деградация - разрушение эмбрионов. Стадия развития играет важную роль в процедуре криоконсервации. Замораживаются эмбрионы на стадиях зигот, 2-х, 4-х, 8-ми клеток и бластоцисты.
Возможные исходы при криоконсервации и размораживании эмбрионов
Необходимо понимать, что эмбрионы после процедуры криоконсервации и размораживания возможно будут непригодны для использования в переносе из-за их деградации (разрушения). В таком случае, перенос эмбрионов соответственно не проводится.
В ходе подготовки слизистой оболочки матки проводят гормональный анализ, на основании которого делают вывод о состоянии слизистой оболочки. В случае отклонений гормональных параметров от нормальных процедура переноса эмбрионов невозможна, т.к. слизистая оболочка матки не может быть подготовлена. В таком случае можно провести повторную программу по подготовке эндометрия в следующем цикле.
КАК ЗАМОРАЖИВАЮТСЯ И ХРАНЯТСЯ ЭМБРИОНЫ ПОСЛЕ ЭКО?
Очень аккуратно! Во время процесса заморозки, даже при соблюдении строжайшего порядка в лабораториях ЭКО, эмбрионы должны преодолеть опасность формирования кристаллов льда, чрезмерного изменения температуры, PH и концентрации электролитов в среде, а так же изменения трансмембранного потенциала (transmembrane water movement).
Клетки эмбриона, как и другие живые ткани, содержат воду. Вода формирует острые кристаллы льда, которые разрастаются в процессе заморозки. Если их не убрать в самом начале, эмбрион может разорваться. При замораживании также образуются губительные для эмбриона соли в воде. Во избежание этой проблемы, из эмбрионов вода удаляется и заменяется криозащитным раствором, который не формирует льда. Эмбрионы помещаются в солевой раствор фосфатного буфера на некоторое время (5-10 минут). Затем помещаются в раствор высококонцентрированного проникающего криопротектора (highly osmotic cryoprotectant fluid). Эмбрион временно сжимается, т.к. быстро дегидрируется. Затем быстро расширяется обратно, когда криопротектор замещает воду. Эта процедура занимает всего несколько минут, после чего эмбрион готов к заморозке. В разных клиниках соответствующие протоколы варьируются, но проходят по одному сценарию.
Эмбрионы помещаются в стеклянные или пластиковые соломинки для дальнейшего хранения. Обычно в каждую соломинку на хранение помещаются 1-4 эмбриона из одного протокола с учетом того, сколько эмбрионов планируется в будущем разморозить и сразу подсадить. Соломинки предварительно охлаждаются, помещаются в канистры, которые опускаются в терморегулируемые изолированные хранилища-танки (сосуды Дьюара) с жидким азотом. Постепенный процесс заморозки занимает несколько часов.
СКОЛЬКО ВРЕМЕНИ НУЖНО НА РАЗМОРОЗКУ ЭМБРИОНА?
После того как эмбрионы достали из криобанка, они размораживаются до комнатной температуры меньше чем за минуту или две. Но полностью процесс разморозки занимает около 40 минут перед тем как эмбрионы готовы к переносу или дальнейшей заморозке.
КАК ПРОИСХОДИТ РАЗМОРАЖИВАНИЕ?
Эмбрионы достаются из канистр и они остывают до комнатной температуры. В отличие от подготовки эмбрионов к процессу заморозки, здесь криозащитный раствор постепенно удаляется и замещается водой при помещении эмбрионов в высокорастворимые среды, в которых содержится больше воды и меньше криопотекторов. И снова, эмбрион может разорваться при поступлении воды в клетки. Так что этот процесс аккуратно контролируется. Затем эмбрион доводят до температуры тела и подсаживают, либо помещаются в культурную среду в инкубатор в ожидании переноса. Обычно, перед подсадкой качество эмбрионов переоценивается.
ВСЕ ЛИ ЭМБРИОНЫ ПЕРЕЖИВУТ РАЗМОРОЗКУ?
Насколько хорошо эмбрионы переживут разморозку зависит от самого протокола заморозки/разморозки и качества эмбрионов перед заморозкой. Эмбрионы, которые были более высокого качества перед заморозкой, лучше переживают крио. Многие клиники не замораживают эмбрионы неудобоваримого качества. К 3 дню они должны быть минимум 6-ти клеточными и иметь не более 20-25% фрагментаций, иначе они не переживут процесс. Обычно процент разморозки варьируется от 50 до 80 %, достигая в большинстве лабораторий более 70%. Важно узнать процент удачной разморозки в клинике, в которой ты будешь делать протокол.
После разморозки эмбрионы оцениваются. В некоторых все клетки погибнут. Такие эмбрионы называются «атретичными» (atretic). Другие могут иметь часть поврежденных клеток (таких эмбрионов большинство). Повреждения могут быть незначительными или серьезными. Несмотря на то, что процент последующих беременностей несомненно обратно пропорционален степени повреждения эмбриона, такие эмбрионы часто восстанавливаются и все еще имеют возможность привести к рождению ребенка. Такой случай был ярко продемонстрирован самыми первыми родами после крио протокола в Австралии в 1984 году. Эмбрион был заморожен на стадии 8 клеток, но 2 клетки погибли в процессе заморозки/разморозки. Его перенесли 6-ти клеточным. Он выжил, имплантировался и, в конечном итоге, доказал миру, что криоконсервация человеческого эмбриона с успешным исходом возможна. С того времени, бесчисленное количество детей было рождено благодаря этой процедуре и часто после переноса эмбрионов, которые в какой-то степени пережили гибель части своих клеток.
Самое лучшее качество эмбрионов тех, в которых клетки остались на 100% неповрежденными. Было предположено, что большинство таких эмбрионов настолько же жизнеспособны, как если бы они не были заморожены. Но таких эмбрионов немного.
По наблюдениям, эмбрионы с четным количеством клеток имеют преимущества перед эмбрионами с нечетным количеством клеток; они переживают крио на 5-10% больше. Также, по наблюдениям, эмбрионы с донорскими яйцеклетками переносят крио лучше (примерно на 2-5%), чем эмбрионы того же качества с использованием яйцеклетки пары, лечащейся от бесплодия.
Процент выживания также может зависеть от того, на какой стадии был заморожен эмбрион. Есть свидетельство того, что эмбрионы, замороженные на более ранней стадии, лучше переносят крио. Возможно потому, что они более просты по структуре и еще не затронуты мембраны ядра. (По этой причине, если есть очень большое количество эмбрионов хорошего качества, одна порция может быть заморожена на стадии 2PN, другая - помещена в лабораторию для культивирования 8-клеточных эмбрионов и бластоцист для свежего переноса). Однако, также допускается, что балстоцисты могут лучше пережить крио, т.к. у них больше клеток и им проще компенсировать потерю некоторых из них. На практике, происходит по-разному и зависит от варианта крио протокола, используемого в каждой отдельной лаборатории. Что бы не применяла твоя клиника, самое главное, чтобы это приводило у них к результату.
ЧЕРЕЗ КАКОЕ ВРЕМЯ ПОСЛЕ РАЗМОРОЗКИ ПЕРЕНОСЯТСЯ ЭМБРИОНЫ?
Бластоцисты и эмбрионы на стадии деления могут быть перенесены сразу после разморозки (через 0-6 часов). А эмбрионы, замороженные на более ранней стадии часто культивируются еще один день и переносятся на стадии деления или бластоцисты.
Теоретически эмбрионы могут оставаться замороженными неограниченное количество времени, т.к. во время криоконсервации нет биоактивности. В практике, неизвестно, сколько по времени они остаются жизнеспособными. Первые крио переносы которые привели к рождению ребенка, проводились в середине восьмидесятых. С того момента, 12-летние крио эмбрионы дали беременность. Крио протоколы усовершенствуются и, возможно, недавно замороженные эмбрионы дадут лучший результат.
Процент успеха при переносе крио эмбрионов обычно ниже, чем со свежими.
Это может происходить по причине повреждения эмбриона при заморозке/разморозке, но и также из-за того, что во взятом протоколе эмбрионы лучшего качества уже были перенесены свежими. К тому же, у пациентов в крио протоколе, уже была неудача, нежели у проходящих свежий протокол.
МОЖНО ЛИ ЗАМОРАЖИВАТЬ ЭМБРИОНЫ БОЛЬШЕ ОДНОГО РАЗА?
Да. Иногда, когда большое количество эмбрионов замораживаются на ранней стадии развития (2PN), все или большее число из них будет разморожено и культивировано. Как и в свежем протоколе, для подсадки будут выбраны эмбрионы лучшего качества, а остальные заморожены снова. Перенос дважды замороженных эмбрионов приводит к рождению ребенка, но некоторые из тех же факторов, которые влияют на эффективность процедуры после переноса крио эмбрионов (по сравнению со свежими), могут уменьшить процент успеха в протоколах с дважды замороженными эмбрионами.
