Created with Sketch. Created with Sketch. Created with Sketch. Created with Sketch. Created with Sketch. Created with Sketch. Created with Sketch. Created with Sketch. Created with Sketch. Created with Sketch. Created with Sketch. Created with Sketch. Created with Sketch. 1 Created with Sketch. Created with Sketch. Created with Sketch. Created with Sketch.
Сообщество ЭКО - мама

ЗАПИСЬ

Ольга 23 октября 2014, 15:28 , Москва ···

Сравнительная геномная гибридизация, CGH array

Метод сравнительной геномной гибридизации на микрочипах (aCGH) позволяет одновременно оценить все 24 хромосомы. Данный метод обладает высокой чувствительностью и точностью и позволяет проводить анализ по единственной клетке. Валидация метода aCGH, по данным литературы, показала его высокую эффективность: только для 2,9% эмбрионов результат анализа не был получен, а уровень ошибки составил 1,9%.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ:


Методом а
CGH проведена диагностика на 70 бластоцистах у 11 пациенток. Возраст пациенток составил от 25 до 43 лет. Эмбрионы культивировали до 5-го дня, согласно стандартным протоколам лаборатории ЭКО, в индивидуальных каплях на средах фирмы «Origio» в условиях пониженного содержания кислорода (5% О2, 6% СО2). На 4-й день развития всем эмбрионам был выполнен вспомогательный хэтчинг с использованием лазера (Saturn, RI). В случае проведения диагностики на ранее замороженных бластоцистах эмбрионы размораживали накануне, проводили вспомогательный хэтчинг, а биопсию выполняли на следующий день, после чего повторно замораживали. На 5-й день развития на эмбрионах хорошего качества была проведена биопсия клеток трофэктодермы с использованием лазера. Эмбрионы, не достигшие соответствующей стадии развития,
культивировали до 6-го дня для последующей биопсии в случаях, если она становилась возможна. Сразу после проведения биопсии все бластоцисты были заморожены методом витрификации. Дальнейшие преамплификация, амплификация, гибридизация проб и анализ результатов проводились согласно стандартному протоколу (24
Sure, BlueGnome).


РЕЗУЛЬТАТЫ:

Результат получен для 64 бластоцист (табл. 2).

В 6 (8,6%) случаях анализ не проведен вследствие отсутствия амплификации ДНК биопсированного материала. Из 64 проанализированных эмбрионов 33 (51,6%) не имели численных аномалий хромосом, 22 (34,4%) эмбриона имели анеуплоидию по одной из хромосом (моно- или трисомия), у 9 (14,1%) эмбрионов отмечены многочисленные анеуплоидии. Четырем пациенткам выполнен селективный перенос одного размороженного эмбриона после диагностики методом aCGH. В первых двух случаях клиническая беременность подтверждена при ультразвуковом исследовании (УЗИ). Третий перенос - положительный анализ ХГЧ. Результат последнего переноса пока неизвестен. Первый случай беременности - пациентка 40 лет. Клинический диагноз: вторичное бесплодие, эндокринный фактор (гиперпролактинемия, ановуляция), старший репродуктивный возраст. Показанием к проведению предимплантационной диагностики методом CGH явились возраст пациентки и наличие в анамнезе спонтанного выкидыша в сроке беременности 7 нед. Контролируемую овариальную стимуляцию проводили в стандартном длинном протоколе с агонистами ГнРГ (диферелин 0,1 и гонал-Ф). В результате пункции фолликулов получено 15 ооцитов. Диагностика проведена на 9 бластоцистах. Только 3 эмбриона не имели хромосомной патологии. После переноса одного эмбриона наступила прогрессирующая беременность плодом женского пола. В настоящее время проведен УЗИ-скрининг II триместра беременности. Второй случай беременности - пациентка 37 лет. Клинический диагноз: вторичное бесплодие, эндокринный фактор (синдром поликистозных яичников). В анамнезе у пациентки две неразвивающиеся беременности в сроке 5 и 9 нед. Контролируемую овариальную стимуляцию проводили в протоколе с антагонистами ГнРГ (оргалутран, пурегон). В качестве триггера использовали агонист ГнРГ (декапептил). В результате пункции фолликулов получено 43 ооцита. Перенос эмбрионов в лечебном цикле не производили из-за риска развития синдрома гиперстимуляции яичников.У части эмбрионов хорошего качества на 3-й день развития проведена биопсия бластомера с последующей диагностикой методом FISH. По результатам анализа 3 хромосом (X, Y, 21) у 10 (42%) из 24 эмбрионов были выявлены анеуплоидии, 14 (58%) эмбрионов не имели численных отклонений по этим хромосомам и 9 из них достигли стадии бластоцисты и были витрифицированы. Часть эмбрионов, на которых не проводили биопсию бластомера, культивировали до 5-го дня развития. Пять эмбрионов достигли стадии бластоцисты хорошего качества, и на них была проведена биопсия трофэктодермы с последующей aCGH. Первый перенос размороженных эмбрионов проводили с использованием эмбрионов, диагностированных методом FISH. Для переноса были взяты 2 эмбриона хорошего качества, однако беременность не наступила. По результатам aCGH только 2 эмбриона не имели хромосомной патологии. Один из них был перенесен в следующем цикле. На 4-й неделе после переноса биохимическая беременность была подтверждена клинически. При проведении ПГС методом FISH на эмбрионах 3-го дня развития в нашей клинике проводится анализ хромосом 13, 14, 15, 16, 18, 21, 22, X, Y - наиболее часто встречающихся анеуплоидий , при наличии которых возможно рождение ребенка с генетической патологией, а также хромосомной патологии, наиболее часто встречающейся при неразвивающихся беременностях. Однако по результатам метода aCGH, 14 эмбрионов были анеуплоидными по другим хромосомам, и данные эмбрионы не были бы исключены при использовании стандартной методики
FISH и могли быть взяты для переноса, что снизило бы результативность применения программ ВРТ.В дальнейшем планируется накопление и анализ собственных данных.При внедрении методики в хорошо оснащенной
лаборатории, с высокими показателями результативности можно предполагать повышение эффективности программ ВРТ в группах пациенток старшего репродуктивного возраста, пациенток с несколькими предыдущими неудачными попытками ЭКО, а также при носительстве сбалансированных структурных хромосомных аномалий.

В настоящее время кариотипирование единичных бластомеров или клеток трофэктодермы проводят с помощью сравнительной геномной гибридизации генетического материала, получаемого из этих клеток эмбриона на ранних стадиях его развития, на микрочипе (по-английски Array-based Comparative Genomic Hybridization - aCGH). Микрочип представляет собой миниатюрное стекло (идентичное по размерам обычному предметному стеклу для микроскопа), на которое в строго определенном порядке нанесены фрагменты ДНК различных участков всех хромосом человека. Генетический материал, полученный из исследуемого эмбриона, фрагментируют и метят специальными флуоресцентными красителями, позволяющими впоследствии легко детектировать ДНК. После этого проводят гибридизацию исследуемой ДНК с микрочипом, т. е. с теми фрагментами нормальной ДНК, которые нанесены на него.

После этого, зная соответствие каждого микрометра поверхности микрочипа определенному фрагменту определенной хромосомы, можно судить о копийности этого локуса в исследуемом образце. Таким образом, проводится анализ потери или наличия лишних хромосом (анэуплоидий), крупных хромосомных перестроек (делеций, дупликаций).

Однако мало кто знает, что столь мощный и высокоразрешающий метод, как aCGH, был разработан и применяется в клинической практике не так давно. Первоначально сравнительная геномная гибридизация заключалась в сравнении паттерна гибридизации меченой ДНК, выделенной из исследуемого биологического образца, с меченной другой краской ДНК, выделенной из нормального контрольного образца, на препарате метафазных хромосом [3]. В норме фрагменты ДНК из исследуемого и контрольного образцов равномерно покрывают окрашенный ими препарат метафазных хромосом, которые в таком случае окрашиваются смешанных цветом. Если в исследуемом образце имеется крупная делеция какого-либо участка (или всей) хромосомы, на метафазных хромосомах в этом месте будет гибридизоваться только контрольная ДНК, что приведет к окраске этого локуса только одной краской, соответствующей нормальной ДНК. Если же какой-то локус (или целая хромосома) окрашен только краской, соответствующей исследуемому образцу, это свидетельствует о том, что данный локус дуплицирован в исследуемом образце или же что имеет место лишняя хромосома.

Понятно, что разрешающая способность, т. е. и способность детектировать небольшие перестройки хромосом, метода сравнительной геномной гибридизации на метафазных хромосомах не высока, и с его помощью можно «разглядеть» лишь очень крупные перестройки или диагностировать существенные изменения в кариотипе, как-то: потеря или приобретение целой хромосомы или ее большой части (например, целого плеча).

Разрешающая способность a-CGH (array Comparative Genomic Hybridization), выполняемой на микрочипах, значительно выше. Однако следует различать СГГ, как метод молекуляроного кариотипирования, и как метод детекции анэуплоидий (неправильного числа хромосом). Максимальная чувствительность метода требуется, например, для установления генетической причины заболеваний, сопряженных с делециями, у больных детей. Также сложные случаи пренатальной диагностики, когда нужно установить причину врожденных пороков развития плода, требует СГГ высокого разрешения (молекулярного кариотипирования). С другой стороны, в практике ПГД - преимплантационной генетической диагностики - используется вариант СГГ с меньшим разрешением. Дело в том, что в геноме человека возможно бесконечное количество перестроек, и клиническое значение большинства из них неизвестно. Поэтому такие «случайные находки» происходили бы постоянно, но отбраковывать на основании таких данных эмбрион - неправильно. Основная задача преимпланатационного скрининга - отсеять эмбрионы с заведомо патологическими мутациями, такими, как лишняя или недостающая хромосома, и при этом провести анализ на минимально возможном количестве материала, чтобы не снижать жизнеспособность эмбриона.


Еще много инфы тут

1

КОММЕНТАРИИ

Eva 23 октября 2014, 18:35 , Санкт-Петербург
                                    

Хороший материал, спасибо. Поговори с врачом, я бы сделала, конечно. Жаль что мне даже это уже не поможет.

Ответить
Ольга 23 октября 2014, 21:57 , Москва
                                    

Спасибо, Жень!

Зато у вас есть четкий план, это уже так много:)

Ответить
Eva 23 октября 2014, 22:16 , Санкт-Петербург
                                    

Блина:) гдеб гарантии взять, а?)) на чоткий план:))))))

Мне оч понравилась эта статья. Была бы возможность - обязательно бы сделала.

Ответить
Ольга 24 октября 2014, 09:30 , Москва
                                    

Да, гарантий в нашем деле никаких, увы :((

Я хочу, поэтому буду врача распрашивать про это дело.

Ответить
natka-natka 23 октября 2014, 17:50 , Киев
                                    Мы делали CGH нашим 6 бластоцистам. Не смотря на очень пессимистические прогнозы, 4 оказались здоровы!!! Две в животике, две заморожены.
Ответить
Ольга 23 октября 2014, 21:58 , Москва
                                    

Наталья, спасибо огромное, что делитесь личным опытом.

Ответить
natka-natka 23 октября 2014, 22:24 , Киев
                                    На форуме Пробирка есть целый раздел, посвящённый ПГД в целом и CGH в частности, там женщины делятся своим опытом. Много инфы про клиники, где делают эту процедуру, и про результаты. В разделе Клиники Украины, в теме "Киев — надежда есть!" девочки ведут таблицу результативности CGH по протоколам форумчанок.
Ответить
Ольга 24 октября 2014, 09:29 , Москва
                                    

Да, видела, спасибо большое! Знаю, в Надии очень хорошо СГГ делают

Ответить
natka-natka 24 октября 2014, 11:32 , Киев
                                    Вы знаете, в целом да. НО! Было несколько моментов. Во-первых, три раза было такое, что после СГГ не размораживались эмбрионы (у 3х разных девочек), хотя, как правило, бластоцисты очень хорошо переносят крио. Во-вторых, вот недавно выяснилось, что у одной девочки таки не смогли проанализировать один эмбрион из 6. Я так понимаю, что могут взять кусочек трофэктодермы, в котором нет ДНК. Но в целом они одними из первых начали делать СГГ, с 2011 года, уже много результатов.
Ответить
Ольга 24 октября 2014, 11:50 , Москва
                                    

Ой-ой, сколько от Вас полезной информации. Вот спасибищиsuper_smilies054.gif

Ответить
Ольга 24 октября 2014, 12:05 , Москва
                                    

Вечером погляжу обязательно ,с работы нет доступа

Ответить
natka-natka 24 октября 2014, 11:59 , Киев
                                    Если что — спрашивайте! Буду рада помочь... Счас дам ссылку на табличку статистики
Ответить
Дивная 9 марта 2016, 23:27
                                    

А вы не смотрели в дальнейшем статистику cgh?

Ничего в лучшую сторону не изменилось? очень плохо ориентируюсь на пробирке. эко делаю не в Киеве. Ужасно переживаю. Хочу поучаствовать в статистике пробирки. Можно попросить ссылочку, где это обсуждают?
Ответить
natka-natka 10 марта 2016, 09:22 , Киев
                                    

Я выпала из обсуждения ))) Года на 2 ещё точно. Две криошки после CGH у нас остались, ждут.
Вот тут ветка обсуждений http://www.probirka.org/forum/viewtopic.php?f=109&t=3557&start=1960

Ответить
Марина 24 октября 2014, 10:46 , Москва
                                    

Оль, а там какая статистика у девчонок?

Ответить
Ольга 24 октября 2014, 11:00 , Москва
                                    

Ты знаешь, там прямо не сказать, что статистика (может я не видела), но вот ветка про ПГД и СГГтут

Ответить
Марина 23 октября 2014, 17:14 , Москва
                                    

Ужасно низкий процент хороших эмбрионов(( Интересно, а если сравнить 9 эмбрионов из одного протокола и 9 из нескольких, то количество хороших всегда 3 или может во втором случае побольше?  ну, это я так смутно надеюсь))

Ответить
Ольга 23 октября 2014, 17:17 , Москва
                                    

Марин, я сама офигела. Процент низкий :(

Совсем я запуталась, что нам делать..

А вот это уже хз..

Ответить
Марина 23 октября 2014, 17:22 , Москва
                                    

Если денежка позволяет, лучше проверь их. А то так искать иголку в стоге сена — рехнешься.

Ответить
Ольга 23 октября 2014, 17:33 , Москва
                                    

Наверное, буду проверять. вот только с Мосесовой поговорю.

Ответить
Марина 23 октября 2014, 17:21 , Москва
                                    Но ты учти, что этот процент у возрастных. У тебя все должно быть лучше. Жаль, они не указали возраст исследуемых женщин.
Ответить
Ольга 23 октября 2014, 17:34 , Москва
                                    

Там указан в начале общий возраст, точнее его разброс.

Ответить
Алла (не устала :) и поменяла аву 23 октября 2014, 16:11 , Москва
                                    

ой Оль..

вы решились на это исследование?

или ты просто для инфы?

Ответить
Ольга 23 октября 2014, 16:13 , Москва
                                    

Алл, я хочу, но еще с доком буду обсуждать.

Тут просто часто про СГГ спрашивают, вот и написала :)

Ответить
Ольга 23 октября 2014, 16:41 , Москва
                                    

Вот просто думаю. сделать три переноса по 2 или СГГ?..

Ответить
Алла (не устала :) и поменяла аву 23 октября 2014, 17:38 , Москва
                                    

Оль, не знаю :(

тут надо с мужем думать.. :(

для меня  в этом всем еще много всяких морально-этических вопросов.. на которые у меня нет ответа..

Ответить
Алла (не устала :) и поменяла аву 23 октября 2014, 22:30 , Москва
                                    ой, Оль.. даже озвучивать не буду :) забудь :) глупость. 

Ответить
Bridget * Бриджит 23 октября 2014, 16:15 , Москва
                                    

Желаю тебе удачно пообщаться на эту тему с Ю Е)))) super_smilies086.gif  Может она наставит на путь истинный и все получится на этот раз angel.gif
Ответить
Ольга 23 октября 2014, 16:18 , Москва
                                    

Олесь, спасибо тебе большое!

Правда у нас, по-ходу, только одна клиника СГГ делает...И в Питере еще

Ответить
Bridget * Бриджит 23 октября 2014, 16:34 , Москва
                                    

Ну, вот просто мнение Ю Е интересно узнать на эту тему)))
Ответить
Bridget * Бриджит 23 октября 2014, 17:08 , Москва
                                    

big_smiles_280.gif да, и мысли опять наслоятся в очередной раз и вопросов станет еще юольше big_smiles_280.gif  
Ответить
Bridget * Бриджит 23 октября 2014, 18:13 , Москва
                                    

Ну, ладно тебе... я ж шютю и все будет тока пучком!!! Ю Е тучи разведет руками, вот увидишь big_smiles_142.gif  Не забудь парик и черные очки одеть с усами boss.gif
Ответить